Dapagliflozyna jako nowa opcja ochrony nerek przed uszkodzeniem niedokrwiennym

Jakie mechanizmy kryją uszkodzenia nerek przy I/R?

Limb ischemia/reperfusion (I/R) injury stanowi istotne zjawisko patofizjologiczne występujące w kontekście chirurgicznym, urazowym lub w chorobach naczyniowych. Proces ten rozpoczyna się od początkowego ograniczenia przepływu krwi z powodu niedrożności, prowadząc do niedokrwienia kończyny. Chociaż następnie dochodzi do przywrócenia dopływu krwi, faza reperfuzji wyzwala szereg niekorzystnych reakcji fizjologicznych. Reperfuzja może nasilić nie tylko lokalne uszkodzenie tkanki, ale również prowadzić do uszkodzenia odległych narządów, szczególnie nerek, skutkując ostrym uszkodzeniem nerek. Nerki są wyjątkowo podatne na uszkodzenia związane z I/R ze względu na ich wysoką aktywność metaboliczną i zapotrzebowanie na tlen, co manifestuje się jako ostra martwica kanalików, obrzęk komórek nabłonka kanalików nerkowych, zwężenie światła, niedrożność i zanik kłębuszków nerkowych. Uszkodzenie nerek wywołane I/R kończyn stało się krytycznym problemem wymagającym rozwiązania w kontekście chirurgii naczyniowej.

Mechanizmy leżące u podstaw uszkodzenia nerek po I/R kończyn są wieloczynnikowe i obejmują kaskadę szlaków molekularnych związanych ze stresem oksydacyjnym, stanem zapalnym i śmiercią komórkową. Brak tlenu i składników odżywczych podczas fazy niedokrwiennej powoduje akumulację reaktywnych form tlenu (ROS), potencjalnie wywołując uszkodzenia komórkowe i aktywując szlaki zapalne. Wzrost stresu oksydacyjnego i pojawienie się ostrych reakcji zapalnych wyzwalają patologiczną kaskadę, taką jak rozległe uszkodzenie kanalików, apoptotyczna śmierć komórek i związana z tym niewydolność nerek. Szlaki sygnałowe kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK) i sirtuiny 1 (SIRT1) są kluczowe dla utrzymania równowagi energetycznej komórek i odpowiedzi na stres. AMPK działa jako główny regulator poziomów energii w komórkach, aktywując się w stanach niskiego poziomu energii i ułatwiając procesy kataboliczne przy jednoczesnym hamowaniu anabolicznych. Natomiast SIRT1, deacetylaza zależna od NAD+, uczestniczy w licznych procesach komórkowych, takich jak stan zapalny, metabolizm i starzenie. Ostatnie badania podkreślają wzajemne oddziaływanie między AMPK a SIRT1 w modulowaniu inflammasomu NLRP3 (zawierającego domenę pirynową 3 z rodziny receptorów NOD-podobnych), który jest istotnym elementem odpowiedzi immunologicznej wrodzonej, aktywowanym przez stres komórkowy i uszkodzenia. Interakcja między tymi komponentami sugeruje ich potencjalny udział w uszkodzeniu nerek po I/R kończyn.

Czy dapagliflozyna może stać się przełomem w ochronie nerek?

Obecnie opcje terapeutyczne dla uszkodzenia nerek wynikającego z I/R kończyn są ograniczone, a istniejące badania podkreślają potencjalne korzyści terapii przeciwzapalnych i przeciwutleniających. Dapagliflozyna, inhibitor kotransportera sodowo-glukozowego 2, okazała się obiecującym środkiem w leczeniu cukrzycy i chorób sercowo-naczyniowych. Jej działanie ochronne wykracza poza kontrolę glikemii, obejmując właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające i antyapoptotyczne. Wykazano, że leczenie dapagliflozyną zwiększa zdolność waskulogeniczną komórek progenitorowych śródbłonka i zmniejsza zapalenie oraz poziomy stresu oksydacyjnego poprzez aktywację sygnalizacji AMPK. Ponadto dapagliflozyna zmniejsza przepuszczalność naczyń siatkówki poprzez hamowanie ekspresji NLRP3, IL-18, kaspazy-1 i NF-κB w modelach retinopatii cukrzycowej. Ostatnie badania wykazały, że dapagliflozyna wykazuje właściwości ochronne przeciwko różnym formom uszkodzenia nerek. W szczególności dapagliflozyna poprawiła włóknienie śródmiąższowe nerek i funkcję nerek w modelach jednostronnej niedrożności moczowodu. Dodatkowo dapagliflozyna zapobiegała ostremu uszkodzeniu kanalików nerkowych wywołanemu przez krążenie pozaustrojowe u królików. Wieloaspektowe mechanizmy działania dapagliflozyny sugerują jej potencjalną rolę w łagodzeniu uszkodzenia nerek związanego z I/R kończyn.

Badanie to miało na celu ocenę, w jaki sposób dapagliflozyna chroni przed uszkodzeniem nerek spowodowanym I/R kończyn w modelu in vivo, a także jej wpływu na komórki HK-2 poddane hipoksji-reoksygenacji (H/R) in vitro. Ponadto badanie analizowało potencjalny związek między korzystnymi efektami dapagliflozyny a aktywacją szlaku sygnałowego AMPK/SIRT1/NLRP3.

W badaniu wykorzystano szczury Sprague-Dawley, które losowo podzielono na cztery grupy: kontrolną, pozornie operowaną, I/R oraz I/R + dapagliflozyna. Myszy w grupach kontrolnej, pozornie operowanej i I/R otrzymywały równoważną objętość 0,9% soli fizjologicznej przez zgłębnik, podczas gdy grupa I/R + dapagliflozyna otrzymywała dapagliflozynę w dawce 1 mg/kg/d tą samą metodą. Po dwóch tygodniach leczenia wszystkie myszy zostały poddane anestezji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,2% pentobarbitalu sodu w dawce 60 mg/kg. W grupie pozornie operowanej odsłonięto tętnicę udową prawej kończyny tylnej, po czym zamknięto nacięcie bez powodowania urazu I/R. W grupach I/R i I/R + dapagliflozyna podobnie odsłonięto prawą tętnicę udową i zastosowano gumową opaskę do zablokowania prawej tylnej tętnicy udowej, powodując zmniejszoną perfuzję kończyny przez trzy godziny, a następnie zwolniono opaskę, aby rozpocząć reperfuzję przez cztery godziny. Po 24 godzinach szczury uśmiercono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu. Pobrano próbki krwi i nerek do dalszych analiz.

Jakie dowody potwierdzają działanie ochronne dapagliflozyny?

Uszkodzenie mięśni oceniano poprzez pomiar stężenia kinazy kreatynowej (CK), mioglobiny (MYO) i dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w surowicy. Ocena funkcji nerek obejmowała pomiar stężenia cząsteczki uszkodzenia nerek 1 (KIM-1), azotu mocznikowego (BUN), lipokaliny związanej z żelatynazą neutrofilową (NGAL) i kreatyniny (CRE) w surowicy. Do oceny stresu oksydacyjnego i reakcji zapalnych wykorzystano pomiary peroksydazy glutationowej (GSH-Px), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), dialdehydu malonowego (MDA), interleukiny 6 (IL-6) i czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α). Poziomy wewnątrzkomórkowego ROS mierzono przy użyciu 2′,7′-dichlorofluorescyny dioctanu (DCFH-DA). Analizę histologiczną przeprowadzono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz mikroskopii elektronowej.

W badaniach in vitro wykorzystano ludzkie komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerek, konkretnie komórki HK-2, które hodowano w medium DMEM/F12 wzbogaconym 10% FBS w nawilżonym środowisku zawierającym 5% (v/v) CO2 w temperaturze 37°C. Do ustalenia modelu H/R: po odrzuceniu oryginalnego medium, komórki HK-2 przemyto PBS, a następnie hodowano w medium DMEM/F12 bez FBS i bez cukru w inkubatorze trójgazowym (5% CO2, 1% O2, 37°C), aby wywołać środowisko hipoksyczne. Po 24 godzinach inkubacji medium zastąpiono normalnymi warunkami, a komórki inkubowano w inkubatorze 5% CO2 przez 2 godziny, aby ułatwić reoksygenację. Grupy eksperymentalne skategoryzowano następująco: grupa kontrolna (traktowana nośnikiem), grupa modelowa (narażona na H/R), grupa model + dapagliflozyna (wstępnie traktowana 5 μmol/L dapagliflozyny przez 3 godziny przed H/R) oraz grupa model + dapagliflozyna + AMPK-siRNA (transfekowana AMPK siRNA przed wstępnym traktowaniem dapagliflozyną przez 3 godziny, a następnie narażona na H/R).

Do oceny pyroptozy komórkowej wykorzystano barwienie TUNEL, analizę cytometryczną oraz pomiar potencjału błony mitochondrialnej (MMP) przy użyciu barwienia JC-1. Ekspresję białek związanych ze szlakiem AMPK/SIRT1/NLRP3 badano metodą Western blot, a ekspresję mRNA przy użyciu RT-qPCR.

Oceniliśmy potencjał błony mitochondrialnej (MMP) komórek HK-2 poprzez barwienie JC-1, aby ocenić wpływ dapagliflozyny na uszkodzenie mitochondriów wywołane przez H/R. Wyniki wykazały zmniejszenie MMP komórek HK-2 w grupie modelowej. Jednak leczenie dapagliflozyną doprowadziło do znacznego wzrostu MMP w porównaniu z grupą modelową. Z kolei AMPK siRNA zniosło efekty dapagliflozyny. Wyniki te sugerują, że dapagliflozyna zapewnia ochronę komórkom nerkowym przed stresem oksydacyjnym, stanem zapalnym i pyroptozą poprzez szlak zależny od AMPK.

Aby zbadać wpływ dapagliflozyny na aktywację szlaku sygnałowego AMPK/SIRT1/NLRP3 w celu złagodzenia pyroptozy wywołanej przez H/R w komórkach HK-2, oceniliśmy poziomy ekspresji białek i mRNA związanych z tym szlakiem sygnałowym. Nasze wyniki wskazały, że leczenie dapagliflozyną znacznie podwyższyło poziomy białek p-AMPK i SIRT1, jednocześnie wyraźnie zmniejszając poziomy NLRP3, ASC, cleaved-caspase-1, cleaved-GSDMD i cleaved-IL-1β w porównaniu z grupą modelową. Wyciszenie AMPK utrudniło efekt dapagliflozyny na aktywację SIRT1 i zniwelowało jej hamujący wpływ na NLRP3, ASC, cleaved-caspase-1, cleaved-GSDMD i cleaved-IL-1β. Komórki HK-2 traktowane dapagliflozyną wykazały znaczny wzrost ekspresji mRNA AMPK i SIRT1, wraz ze znacznym zmniejszeniem ekspresji mRNA NLRP3, ASC, kaspazy-1, GSDMD i IL-1β. Jednak efekty dapagliflozyny zostały zmniejszone po wyciszeniu AMPK. Wyniki te wskazują, że dapagliflozyna łagodzi pyroptozę wynikającą z H/R w komórkach HK-2 poprzez szlak sygnałowy AMPK/SIRT1/NLRP3.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za nefroprotekcją?

Ostre uszkodzenie nerek wynikające z I/R stanowi poważne wyzwanie, komplikując rekonwalescencję i prowadząc do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności wśród dotkniętych osób. Dlatego poszukiwanie skutecznych interwencji terapeutycznych w celu złagodzenia tych szkodliwych skutków pozostaje priorytetem. Niedokrwienie-reperfuzja kończyny prowadzi do miejscowego uszkodzenia mięśni i uwolnienia CK, MYO, LDH i innych wewnątrzkomórkowych składników mięśni, co może nasilić uszkodzenie nerek. W tym badaniu stwierdziliśmy, że dapagliflozyna znacznie złagodziła uszkodzenie mięśni poprzez zmniejszenie poziomów CK, MYO i LDH w surowicy po I/R kończyn. Ponadto znacznie poprawiła funkcję nerek poprzez zmniejszenie poziomów CRE, BUN, NGAL i KIM-1 w surowicy po I/R kończyn u szczurów. Dapagliflozyna znacznie obniżyła stres oksydacyjny i odpowiedź zapalną zarówno w surowicy, jak i w tkankach nerkowych po I/R kończyn. Dodatkowo dapagliflozyna skutecznie zmniejszyła produkcję ROS i poprawiła histopatologię nerek, jednocześnie zwiększając przeżywalność komórek.

Wyniki wykazują, że dapagliflozyna wywiera istotne działanie ochronne przeciwko uszkodzeniu nerek spowodowanemu I/R kończyn. Nasze badania wykazały, że działanie renoprotekcyjne dapagliflozyny jest związane z jej wpływem na szlak AMPK/SIRT1 i szlak pyroptozy mediowanej przez inflammasom NLRP3, co sugeruje jej potencjał jako obiecującej opcji terapeutycznej w zapobieganiu uszkodzeniom nerek w warunkach klinicznych. Jest to pierwsze kompleksowe badanie potencjalnego działania ochronnego dapagliflozyny przeciwko uszkodzeniu nerek spowodowanemu I/R kończyn.

Interakcja różnych czynników prowadzących do uszkodzenia nerek w kontekście I/R kończyn stanowi złożony i wieloaspektowy proces. Centralnymi mechanizmami tego zjawiska są reakcje zapalne, stres oksydacyjny, dysfunkcja mitochondriów i aktywacja różnych szlaków śmierci komórkowej. Pyroptoza, niedawno odkryty rodzaj programowanej śmierci komórki związanej z martwicą zapalną, jest związana z inicjacją i rozwojem ostrego uszkodzenia nerek po I/R. W tym procesie NLRP3 wiąże się z ASC, tworząc kompleks inflammasomu, który następnie aktywuje kaspazę-1. Ta aktywacja prowadzi do hydrolizy IL-1β i IL-18, wywołując reakcję zapalną. Ponadto aktywowana kaspaza-1 rozszczepia białko GSDMD, prowadząc do tworzenia porów w błonie komórkowej, co ostatecznie powoduje pyroptozę komórkową. Hamowanie pyroptozy mediowanej przez NLRP3 jest skuteczną strategią terapeutyczną łagodzącą uszkodzenie nerek spowodowane I/R.

ROS są uznawane za powszechne aktywatory inflammasomu NLRP3. W szczególności podczas I/R, akumulacja ROS znacząco przyczynia się do stanu zapalnego tkanek i wyzwala aktywację inflammasomu NLRP3, procesu związanego z uszkodzeniem wielu odległych narządów, takich jak nerki, mózg, serce i jądra. Liczne badania wskazują, że środki farmakologiczne mające na celu zmniejszenie stresu oksydacyjnego, ograniczenie produkcji ROS i w konsekwencji hamowanie aktywacji inflammasomu NLRP3, pozytywnie wpływają na uszkodzenie nerek wywołane przez I/R. Szlak sygnałowy AMPK/SIRT1 okazał się istotnym regulatorem odpowiedzi komórkowych na stres oksydacyjny, wzmacniając obronę antyoksydacyjną i utrzymując homeostazę energetyczną.

W tym badaniu stwierdziliśmy, że dapagliflozyna nie tylko podwyższała poziomy SOD i GSH-PX w surowicy i tkance, jednocześnie obniżając stężenia MDA, ale także zmniejszała produkcję ROS w tkankach nerkowych. Ponadto wykazano, że dapagliflozyna podwyższa zarówno poziomy białka, jak i mRNA AMPK i SIRT1. Wyniki te sugerują, że dapagliflozyna może łagodzić stres oksydacyjny i generowanie ROS poprzez szlak sygnałowy AMPK/SIRT1, co może prowadzić do hamowania pyroptozy mediowanej przez NLRP3. Aby zbadać mechanizm leżący u podstaw działania nefroprotekcyjnego dapagliflozyny, wykorzystaliśmy AMPK siRNA w naszych badaniach in vitro. Co istotne, odkryliśmy, że obniżenie regulacji ekspresji AMPK zmieniło efekty terapeutyczne dapagliflozyny, niwecząc jej zdolność do zmniejszania stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego oraz zmniejszając jej wpływ na pyroptozę mediowaną przez inflammasom NLRP3. Wyniki te sugerują, że AMPK ma kluczowe znaczenie dla właściwości nefroprotekcyjnych dapagliflozyny.

Jakie są kliniczne implikacje badań nad dapagliflozyną?

Podsumowując, nasze badania wykazują, że dapagliflozyna ma zauważalne działanie ochronne przeciwko uszkodzeniu nerek wynikającemu z I/R kończyn. Ten mechanizm ochronny jest ułatwiony przez aktywację szlaku sygnałowego AMPK/SIRT1, który jest niezbędny do zarządzania stresem oksydacyjnym i produkcją ROS. Przeciwdziałając stresowi oksydacyjnemu i zapobiegając późniejszej aktywacji inflammasomu NLRP3 poprzez szlak AMPK/SIRT1, dapagliflozyna znacznie łagodzi odpowiedź zapalną związaną z uszkodzeniem nerek i pyroptozą komórkową. Wyniki te nie tylko podkreślają potencjalne zastosowanie terapeutyczne dapagliflozyny w przypadkach uszkodzenia nerek, ale także otwierają nowe drogi dla nadchodzących badań klinicznych skupiających się na weryfikacji jej skuteczności i bezpieczeństwa u ludzi.

Interakcja różnych czynników prowadzących do uszkodzenia nerek w kontekście I/R kończyn stanowi złożony i wieloaspektowy proces. Centralnymi mechanizmami tego zjawiska są reakcje zapalne, stres oksydacyjny, dysfunkcja mitochondriów i aktywacja różnych szlaków śmierci komórkowej. Pyroptoza, niedawno odkryty rodzaj programowanej śmierci komórki związanej z martwicą zapalną, jest związana z inicjacją i rozwojem ostrego uszkodzenia nerek po I/R. W tym procesie NLRP3 wiąże się z ASC, tworząc kompleks inflammasomu, który następnie aktywuje kaspazę-1. Ta aktywacja prowadzi do hydrolizy IL-1β i IL-18, wywołując reakcję zapalną. Ponadto aktywowana kaspaza-1 rozszczepia białko GSDMD, prowadząc do tworzenia porów w błonie komórkowej, co ostatecznie powoduje pyroptozę komórkową. Hamowanie pyroptozy mediowanej przez NLRP3 jest skuteczną strategią terapeutyczną łagodzącą uszkodzenie nerek spowodowane I/R.

W tym badaniu stwierdziliśmy, że dapagliflozyna wywiera istotne działanie ochronne, poprawiając równocześnie funkcję nerek, likwidując stres oksydacyjny oraz hamując aktywację zapalnych szlaków, w tym inflammasomu NLRP3, co potwierdza jej potencjał terapeutyczny w redukcji uszkodzeń spowodowanych I/R.

Podsumowanie

Badania wykazały, że dapagliflozyna skutecznie chroni nerki przed uszkodzeniem wywołanym przez niedokrwienie i reperfuzję kończyn (I/R). Mechanizm ochronny opiera się na aktywacji szlaku sygnałowego AMPK/SIRT1, który reguluje stres oksydacyjny i produkcję reaktywnych form tlenu. Dapagliflozyna znacząco zmniejsza markery uszkodzenia mięśni (CK, MYO, LDH) oraz poprawia funkcję nerek poprzez redukcję poziomów CRE, BUN, NGAL i KIM-1. Lek hamuje również aktywację inflammasomu NLRP3, co prowadzi do zmniejszenia pyroptozy komórkowej i stanu zapalnego. Wyniki badań in vitro na komórkach HK-2 potwierdziły, że działanie ochronne dapagliflozyny jest zależne od szlaku AMPK, a jego blokada znosi korzystne efekty leku. Odkrycia te sugerują potencjalne zastosowanie dapagliflozyny jako skutecznej opcji terapeutycznej w zapobieganiu uszkodzeniom nerek w warunkach klinicznych.