Dapagliflozyna w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów – nowe perspektywy

Czym jest reumatoidalne zapalenie stawów i jakie mechanizmy je kształtują?

Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) to choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się zapaleniem błony maziowej, degradacją chrząstki, erozją kości i ostatecznie zwyrodnieniem stawów. Globalna częstość występowania waha się od 0,24 do 1%, różniąc się w zależności od regionu i kraju. Pacjenci z RA cierpią na niepełnosprawność fizyczną i zniszczenie stawów, co prowadzi do przedwczesnej śmiertelności i obniżonej jakości życia. Mimo licznych badań, dokładna etiologia i patogeneza pozostają niejasne. Choroba wiąże się z hiperplazją błony maziowej, naciekiem komórek zapalnych i opornością na apoptozę.

Autofagia jest mechanizmem przetrwania, który pomaga eliminować niepotrzebne i wadliwie funkcjonujące części komórki, w tym uszkodzone organelle i agregaty białkowe. Niedawne badania ustaliły związek między chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak RA, a nieprawidłową autofagią. “Tłumienie autofagii w eksperymentalnym modelu myszy z zapaleniem stawów obniżyło liczbę osteoklastów i innych objawów erozji kości, sugerując, że autofagia jest niezbędna dla niszczenia tkanki kostnej” – piszą autorzy badania. Badania przeprowadzone na fibroblastopodobnych synowiocytach (FLS) w RA wykazały oporność na śmierć komórkową i zwiększoną regulację szlaków autofagicznych, co pozwala im namnażać się i naciekać, powodując przewlekły stan zapalny i niszczenie stawów.

Nieprawidłowa modulacja szlaków sygnałowych w stawie została powiązana z nieprawidłową proliferacją FLS i nadmierną produkcją cytokin zapalnych. Różne leczenia mogą pomóc w łagodzeniu objawów i spowolnieniu postępu choroby, w tym niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy i biologiczne modyfikatory choroby. Niemniej jednak, obecne leki przeciwartretyczne nie zapewniają całkowitego wyleczenia RA.

Szlak sygnałowy Sonic Hedgehog (SHh) jest ważną częścią rodziny białek Hedgehog (Hh), która odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym, utrzymaniu tkanek i komórek macierzystych. Gdy ligand Hh wiąże się z receptorem błonowym Patched 1 (Ptch-1), aktywuje Smoothened (Smo), białko podobne do receptora sprzężonego z białkiem G. Cząsteczki poniżej Smo ułatwiają następnie transdukcję sygnału z cytoplazmy do jądra, aktywując czynniki transkrypcyjne Gli 1-3. Wiele ludzkich nowotworów zostało powiązanych z karcinogenezą i przerzutami poprzez niewłaściwą aktywację sygnalizacji Hedgehog. Niedawne badania wykazały, że sygnalizacja Hedgehog jest podwyższona w tkance maziowej pacjentów z RA, sprzyjając proliferacji i migracji FLS. Jednak zaangażowanie sygnału Hedgehog w RA i możliwość celowania w ten szlak jako podejście terapeutyczne nie zostały w pełni zbadane.

Dapagliflozin (DAPA) jest doustnym lekiem hipoglikemicznym z aktywnością hamowania kotransportera sodu-glukozy-2 (SGLT2). Działa poprzez zapobieganie reabsorpcji glukozy przez nerki, poprawiając funkcję wątroby, wspomagając utratę wagi, obniżając poziom kwasu moczowego i obniżając ciśnienie krwi. Działanie przeciwzapalne DAPA zostało udokumentowane w wielu badaniach poprzez różne metody. Według Lee i współpracowników, leczenie DAPA 1 mg/kg/dzień przez 8 tygodni prowadziło do zmniejszonej infiltracji makrofagów i niższych poziomów ekspresji markerów zapalnych mikrogleju-1, w tym TNF-a, IL-1ß i IL-6 w normoglikemicznym modelu miażdżycy u królików. Sugeruje to, że DAPA ma potencjalne działanie przeciwzapalne.

Jak zaprojektowano badanie i jakie modele zastosowano?

Dlatego celem naszego badania było sprawdzenie potencjału terapeutycznego różnych dawek DAPA u szczurów z adjuwant-indukowanym zapaleniem stawów (AIA). Badanie badało również podstawowe mechanizmy przeciwartretycznych działań DAPA samodzielnie lub w połączeniu z metotreksatem (MTX), odkrywając możliwe powiązania między szlakiem sygnałowym Hedgehog, apoptozą i autofagią.

W badaniu wykorzystano samce szczurów Spargue-Dawly o wadze 180-200 g, które były utrzymywane w standardowych warunkach środowiskowych (temperatura 25°C, wilgotność względna 60%, 12-godzinny cykl światło/ciemność) z wolnym dostępem do jedzenia i wody. Model AIA został wywołany przez śródskórne wstrzyknięcie 0,1 ml CFA (Complete Freund’s Adjuvant) w powierzchnię podeszwową lewych tylnych łap szczurów. W tym samym i następnym dniu podano dodatkowe wstrzyknięcie śródskórne 0,1 ml w okolicę ogona.

Badanie zostało przeprowadzone w dwóch fazach. W fazie I przeprowadzono wstępne badanie odpowiedzi na dawkę, aby określić optymalną dawkę terapeutyczną DAPA. Trzydzieści szczurów zostało losowo przydzielonych do 5 grup (n=6): grupa kontrolna, grupa AIA, oraz grupy AIA leczone DAPA w dawkach 1, 5 lub 10 mg/kg/dzień. W fazie II, mającej na celu zbadanie mechanizmu terapeutycznego DAPA, 50 szczurów zostało losowo przydzielonych do 5 grup (n=10): grupa kontrolna, grupa AIA, grupa leczona MTX (0,75 mg/kg/tydzień), grupa leczona DAPA (10 mg/kg/dzień) oraz grupa leczona kombinacją MTX i DAPA.

Ocenę zapalenia stawów przeprowadzono za pomocą indeksu artretycznego (AI), wyniku chodu oraz pomiaru średnicy tylnej łapy. Indeks artretyczny oceniano w skali 0-4, gdzie 0 oznacza brak obrzęku, a 4 poważny obrzęk całej łapy i stawu skokowego. Wynik chodu oceniano w skali 0-3, gdzie 0 oznacza normalny chód, a 3 kulawiznę bez obciążania. Średnicę tylnej łapy mierzono za pomocą cyfrowej suwmiarki.

Po zakończeniu eksperymentu przeprowadzono badanie radiograficzne tylnych łap szczurów, aby ocenić stopień zapalenia stawów. Zmiany radiograficzne oceniano pod kątem zwężenia przestrzeni stawowej, uszkodzenia chrząstki i erozji kości w skali od 0 (normalne) do 3 (ciężkie). Przeprowadzono również badanie histopatologiczne tkanek stawowych barwionych hematoksyliną i eozyną.

Jakie efekty wykazano w ocenach klinicznych i histopatologicznych?

W ramach naszych badań przeprowadziliśmy wstępne badanie odpowiedzi na dawkę, aby określić potencjalne korzyści terapeutyczne DAPA przeciwko modelowi AIA u szczurów, używając trzech różnych dawek (1, 5 lub 10 mg/kg/dzień). Niższe dawki DAPA (1 lub 5 mg) wykazały niewielkie złagodzenie parametrów artretycznych, podczas gdy najwyższa dawka (10 mg) wykazała wybitne działanie przeciwartretyczne w postaci zmniejszenia średnicy łapy, wyniku chodu i indeksu artretycznego (AI) w porównaniu z niższymi dawkami. “Ten nowo odkryty efekt DAPA zatrzymał liczne nieprawidłowości histopatologiczne wywołane przez CFA w sposób zależny od dawki, zachowując prawie normalną, nienaruszoną powierzchnię stawową przy zastosowaniu najwyższej dawki, bez widocznych nieprawidłowych zmian ani nacieków komórek zapalnych” – zauważają badacze.

Nasze wyniki pokazują, że podawanie CFA indukowało zmiany artretyczne potwierdzone przez podwyższony AI, obserwowany stan zapalny i obrzęk łapy, zwiększony wynik chodu i średnicę łapy w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Monoterapia MTX lub DAPA nieznacznie zmniejszyła zarówno AI, jak i wynik chodu u szczurów z zapaleniem stawów, podczas gdy zauważalne poprawy stwierdzono w średnicy łapy. Połączenie DAPA z MTX zapewniło dalszą poprawę wszystkich wskaźników artretycznych w porównaniu z samym MTX lub DAPA.

Przy badaniu radiograficznym podawanie CFA wykazywało zmiany artretyczne u szczurów, które pojawiały się jako obrzęk tkanek miękkich, erozja kości i zwężenie przestrzeni stawowej. Badanie radiograficzne grup leczonych MTX lub DAPA nie wykazało zauważalnego hamowania nieprawidłowości stawów związanych z zapaleniem stawów. Tymczasem jednoczesne leczenie DAPA z MTX znacznie poprawiło zmiany artretyczne w strukturze stawu, szczególnie erozję i przestrzeń stawową, co zostało potwierdzone badaniem histologicznym.

Analiza histopatologiczna tkanek chrząstkowych grupy kontrolnej wykazała normalne struktury chrząstki stawowej, z nienaruszonymi gładkimi powierzchniami. Zaobserwowano dobrze zorganizowane, nienaruszone chondrocyty wewnątrz jamek, pojedyncze lub zgrupowane w różnych strefach z nienaruszoną jednorodną macierzą międzykomórkową. Zaobserwowano również nienaruszone błony maziowe i pokrywający nabłonek z minimalnymi naciekami komórek zapalnych. Tymczasem grupa leczona AIA wykazała liczne ogniskowe erozje powierzchni stawowej i nieregularności, którym towarzyszyły wyraźne rozlane nacieki komórek zapalnych w błonach maziowych i okołostawowej tkance łącznej z przekrwionymi naczyniami krwionośnymi.

Grupa leczona MTX wykazała widoczną nienaruszoną powierzchnię stawową z wieloma postaciami widocznych nienaruszonych chondrocytów w większości głębszych stref chrząstkowych z nienaruszoną macierzą międzykomórkową. Jednak utrzymujące się zapisy poważnych nacieków komórek zapalnych wykazano w błonach maziowych i okołostawowej tkance łącznej z przekrwionymi naczyniami krwionośnymi. Grupa leczona DAPA wykazała widoczne nienaruszone powierzchnie stawowe z wieloma postaciami widocznych nienaruszonych chondrocytów w większości głębszych stref chrząstkowych z nienaruszoną macierzą międzykomórkową. Ponadto zauważono łagodniejsze rozpuszczanie nacieków komórek zapalnych w błonach maziowych.

Grupa leczona jednocześnie MTX/DAPA wykazała widoczną nienaruszoną powierzchnię stawową bez zapisów nieprawidłowych zmian. Ponadto zaobserwowano znaczne zmniejszenie nacieków komórek zapalnych w błonach maziowych i tkance okołostawowej.

Jakie zmiany molekularne związane są z zapaleniem stawów?

W RA, metaloproteinazy macierzy (MMP), w tym MMP-1, MMP-3, MMP-8 i MMP-13, okazały się kluczowym elementem dla zdrowia stawów, rozwoju i progresji choroby. Wcześniejsze badania kliniczne wykazały, że pacjenci z RA mają podwyższone poziomy MMP-1 i MMP-3 w surowicy i płynie maziowym w porównaniu z pacjentami z chorobą zwyrodnieniową stawów i osobami normalnymi, co koreluje z poziomami innych markerów aktywności choroby. Według badań, MMP-1 i MMP-3 odgrywają kluczowe role w patogenezie RA i zostały zasugerowane jako miary progresji choroby i zniszczenia stawów.

Nasze badanie wykazało, że w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi, CFA znacznie podwyższył poziomy MMP-1, MMP-3 i czynnika reumatoidalnego (RF) w surowicy. Co ciekawe, leczenie 10 mg samego DAPA wykazało dramatyczny spadek tych podwyższonych poziomów w surowicy u szczurów z zapaleniem stawów. Ponadto, te krytyczne markery ciężkości reumatoidalnej zostały jeszcze bardziej zmniejszone przez połączony schemat DAPA z konwencjonalnym lekiem MTX w porównaniu zarówno z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów, jak i samym leczeniem MTX.

U szczurów leczonych CFA, oszacowanie poziomów RF, MMP-1 i MMP-3 w surowicy wykazało znaczną regulację w górę o 20, 3 i 5 razy w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Leczenie samym MTX znacznie zmniejszyło zarówno metaloproteinazy macierzy, jak i RF o 0,5 raza w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów. U szczurów leczonych DAPA, poziomy RF, MMP-1 i MMP-3 w surowicy zostały znacznie zmniejszone odpowiednio o 0,6, 0,7 i 0,7 raza w porównaniu z szczurami AIA. Dodatkowo, leczenie samym DAPA wykazało wyraźny spadek zarówno metaloproteinaz macierzy, jak i RF w porównaniu z monoterapią MTX. Jednoczesne leczenie MTX i DAPA wywołało dalsze znaczne zmniejszenie RF, MMP-1 i MMP-3 o 0,4 raza w porównaniu z samym MTX.

Obecne dane pokazały, że wielokrotne iniekcje CFA indukowały systemowy stan zapalny u chorych szczurów, co ilustrują podwyższone poziomy NF-κB w surowicy i następująca kaskada zapalna IL-1β, IL-6 i TNF-α. Według wcześniejszych raportów, doustne podawanie DAPA (5 i 10 mg/kg) wykazało aktywność przeciwzapalną poprzez supresję poziomów metaloproteinaz macierzy ze znacznym hamowaniem poziomów IL-1β, IL-18 i TNF-α w uszkodzeniu płuc pośredniczonym przez lipopolisacharyd.

W tym samym kierunku, ujawniliśmy, że leczenie DAPA (10 mg/kg/dzień) złagodziło przekonany systemowy stan zapalny u szczurów z zapaleniem stawów, co pokazują obniżone poziomy NF-κB p65 i następująca kaskada TNF-α, IL-1β i IL-6. “Zaskakująco, dodanie DAPA do standardowej terapii MTX w obecnym badaniu wykazało dodatkową redukcję poziomów wszystkich cytokin zapalnych w surowicy” – piszą autorzy. To odkrycie wspiera powszechny wpływ przeciwzapalny DAPA, który byłby korzystny w leczeniu RA.

Podawanie CFA znacząco zwiększyło poziomy IL-1β i IL-6 w surowicy odpowiednio o 468 i 668% w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. To znaczące zwiększenie cytokin zapalnych zostało wyraźnie zmniejszone u szczurów leczonych MTX o prawie 54 i 53% odpowiednio w IL-1β i IL-6 w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów. Zaskakująco, leczenie samym DAPA znacznie złagodziło poziomy IL-1β i IL-6 w surowicy odpowiednio o 70 i 72% w porównaniu z szczurami leczonymi AIA i wywołało dalsze zmniejszenie w porównaniu z monoterapią MTX. Jednak współleczenie MTX i DAPA znacznie obniżyło poziomy IL-1β i IL-6 odpowiednio o 41 i 46% w porównaniu z samym leczeniem MTX.

Jak modulowany jest szlak AMPK i apoptoza w RA?

Rzeczywiście, wiele modeli powiązało DAPA ze zwiększoną aktywnością AMPK. Według Faridvand i współpracowników, wstępne leczenie DAPA znacznie zmniejszyło apoptozę indukowaną wysokim poziomem glukozy i aktywność CASP-3 w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej poprzez zwiększoną p-AMPK. W tym samym kontekście, nasze wyniki pokazały, że podawanie CFA ograniczało aktywność fosforylacji AMPK w tkance stawowej, co wyjaśnia podwyższony stan zapalny u nieleczonych szczurów z zapaleniem stawów. Tymczasem leczenie DAPA wykazało dramatycznie zwiększoną aktywność fosforylacji AMPK w tkance stawowej szczurów z zapaleniem stawów.

Szczury AIA wykazały znaczną regulację w dół ekspresji p-AMPK/t-AMPK w tkance stawowej o 84% w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Leczenie samym MTX nie wykazało żadnej znaczącej zmiany w ekspresji p-AMPK/t-AMPK w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów. Wręcz przeciwnie, w porównaniu z szczurami leczonymi AIA, monoterapia DAPA dramatycznie podwyższyła ekspresję p-AMPK/t-AMPK o 374% i osiągnęła dalszy wzrost w porównaniu z monoterapią MTX. Jednak w porównaniu z samym leczeniem MTX, ekspresja p-AMPK/t-AMPK w tkance stawowej była o 230% wyższa u szczurów leczonych jednocześnie DAPA. Godne uwagi, tylko terapia kombinowana odniosła sukces w normalizacji ekspresji p-AMPK/t-AMPK w tkance stawowej i zauważono znaczną różnicę od leczenia monoterapią DAPA.

Badania nad RA wykazały, że jednym z kluczowych czynników patofizjologicznych, szczególnie w przypadkach hiperplazji błony maziowej i rozwoju pannusa, jest zmniejszona wrażliwość apoptotyczna fibroblastów maziowych. Zgłoszono, że w stawie RA, FLS wykazywały zachowanie podobne do nowotworowego, charakteryzujące się nieprawidłową proliferacją i opornością na apoptozę, co z kolei indukowało trwały stan zapalny i uszkodzenie tkanek.

W obecnym badaniu, podawanie CFA znacząco obniżyło poziomy CASP-3 i CASP-9 w tkance stawowej, a także ekspresję genów p53 i stosunek Bax/Bcl2 w tkance stawowej u nieleczonych szczurów z zapaleniem stawów w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Co ciekawe, w porównaniu ze szczurami leczonymi MTX, leczenie samym DAPA znacząco podwyższyło poziomy CASP-3 w tkance chrzęstnej i ekspresję genu p53 w tkance stawowej, podczas gdy nie zanotowano różnicy w CASP-9 i stosunku Bax/Bcl2.

Nasze wyniki pokazały również, że podawanie DAPA w połączeniu z MTX przywróciło upośledzoną apoptozę poprzez znaczący wzrost poziomów CASP-3 i CASP-9 w tkance stawowej, a także podwyższoną ekspresję genu p53 w tkance stawowej w porównaniu z samym leczeniem MTX. W przeciwieństwie do nieleczonych szczurów z zapaleniem stawów, ekspresja Bax/Bcl2 była znacznie zwiększona u szczurów leczonych kombinacją DAPA/MTX. Te odkrycia zgadzają się z wcześniejszymi badaniami, zgłaszającymi wpływ terapeutyczny DAPA na model guza litego myszy poprzez poprawę wskaźnika przeżycia i aktywności CASP-3.

W porównaniu z grupą kontrolną, podawanie CFA znacząco zmieniło ekspresję markerów apoptotycznych u leczonych lub nieleczonych szczurów. Osłabione poziomy CASP-3 i 9 w tkance stawowej zanotowano w grupie AIA odpowiednio o 30 i 39% w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Leczenie samym MTX wykazało znaczne podwyższenie CASP-3 i CASP-9 odpowiednio o 146 i 138% w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów. Z drugiej strony, grupa leczona tylko DAPA wykazała znaczny wzrost poziomów CASP-3 i CASP-9 odpowiednio o 74 i 117% w porównaniu z grupą leczoną AIA. Jednak leczenie samym DAPA wywołało znaczące zmiany w obu kaspazach w porównaniu z monoterapią MTX i znormalizowało CASP-3. Gdy DAPA był podawany wraz z MTX, poziomy CASP-3 i CASP-9 wzrosły znacząco odpowiednio o 114 i 28% w porównaniu z samym leczeniem MTX, a dalsze wzrosty zaobserwowano w stosunku do samego DAPA.

Nieleczone szczury z zapaleniem stawów wykazały 65% wzrost ekspresji genu P53 w tkance stawowej i 85% spadek stosunku Bax/Bcl2 w porównaniu z grupą kontrolną. Po leczeniu szczurów z zapaleniem stawów MTX, ekspresja genu P53 wzrosła o 39%, podczas gdy stosunek ekspresji Bax/Bcl2 wzrósł o 594% w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów. Co ciekawe, w porównaniu z szczurami leczonymi AIA, podawanie samego DAPA znacząco zwiększyło ekspresję genu p53 o 67% i stosunek Bax/Bcl2 o 658% oraz wykazało dodatkowy wzrost niż monoterapia MTX w P53. Łączenie MTX z DAPA skutkowało 78% i 48% wyraźnym wzrostem ekspresji genu P53 w porównaniu z monoterapią MTX lub DAPA. Godne uwagi, wszystkie leczone grupy artretyczne z MTX i/lub DAPA odniosły sukces w normalizacji stosunku ekspresji Bax/Bcl2, podczas gdy nie udało się znormalizować P53.

Czy autofagia stanowi nowy cel terapeutyczny w reumatoidalnym zapaleniu stawów?

W RA, autofagia okazała się odgrywać podwójną rolę, zarówno ochronną, jak i patogenną, w zależności od typu komórki i stadium choroby. Wcześniejsze badania wykazały, że autofagia była zaangażowana w przeżycie RA-FLS i oporność na apoptozę, a także aktywację limfocytów T, różnicowanie osteoklastów i resorpcję kości. Wręcz przeciwnie, autofagia była również powiązana z chondrocytami i utrzymaniem homeostazy chrząstki.

W tym samym kontekście, niedawne badania wykazały, że indukcja autofagii była związana z tłumieniem ciężkości zapalenia stawów i pożądanymi wynikami terapeutycznymi in vivo i in vitro. “Według Ibrahima i współpracowników, DAPA wykazał perspektywiczną korzyść terapeutyczną poprzez modulowanie autofagii w modelu szczura z chorobą Alzheimera, co potwierdzono zwiększoną ekspresją genu Beclin1 w hipokampie” – zauważają badacze.

W naszym badaniu, podawanie CFA dramatycznie obniżyło ekspresję genów ULK-1, Beclin-1 i ATG-7 w tkance stawowej w porównaniu ze szczurami kontrolnymi, prowadząc do znacznej obniżonej regulacji procesu autofagii, co wspiera hipotezę o zaangażowaniu autofagii w hamowanie ciężkości zapalenia stawów. Z tym samym konceptem, nasze badanie wykazało, że leczenie DAPA aktywowało oś autofagii, co potwierdzono przez zauważalną podwyższoną ekspresję genów ULK-1, Beclin-1 i ATG-7 w tkance stawowej.

Wszystkie szczury z zapaleniem stawów, w tym leczone MTX i/lub DAPA, wykazywały wyraźne zmiany we wszystkich parametrach autofagii w porównaniu ze zdrowymi szczurami nieartretycznymi. Szczury zatrucie CFA prezentowały statystycznie znaczną regulację w dół Beclin1, ULK1 i ekspresji genu ATG7 odpowiednio o 57, 35 i 41% w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak leczenie samym MTX znacznie podwyższyło wyżej wymienione markery autofagiczne odpowiednio o 51, 191 i 42% w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów.

Co ciekawe, w porównaniu z szczurami AIA, podawanie DAPA dramatycznie zwiększyło poziomy ekspresji Beclin1, ULK1 i ATG7 odpowiednio o 219, 253 i 171%. Jednak gdy DAPA był współpodawany z MTX, poziomy ekspresji Beclin1, ULK1 i ATG7 wzrosły odpowiednio o 197, 42 i 199% w porównaniu ze szczurami leczonymi samym MTX. Ponadto, terapia kombinowana wywołała dodatkowe eskalacje we wszystkich markerach autofagicznych w porównaniu z używaniem monoterapii DAPA.

Ponadto, uzupełniający schemat terapeutyczny DAPA z MTX dramatycznie podwyższył ekspresję genów ULK-1, Beclin-1 i ATG-7 w tkance stawowej w porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów lub grupami leczonymi MTX. DAPA wywarł podwójny korzystny efekt poprzez wzmocnienie autofagii, a także modulowanie nieprawidłowej apoptozy w modelu RA w podobnym zachowaniu do jego efektu przeciwko modelom nowotworowym. Ten cenny wpływ DAPA w przywracaniu równowagi homeostatycznej między szlakami apoptozy i autofagii w RA pomógłby zapobiec nieprawidłowemu i niekontrolowanemu wzrostowi chorych komórek, co jest głównym czynnikiem w poważności zapalenia stawów i degeneracji stawów.

Jakie znaczenie ma szlak Hedgehog i synergistyczne terapie w RA?

Szlak sygnałowy Hedgehog został powiązany z patogenezą RA, szczególnie poprzez nieprawidłową proliferację i inwazję FLS w błonie maziowej. Badania wykazały, że nieprawidłowa aktywacja szlaku Hedgehog u pacjentów z RA przyczyniała się do namnażania i migracji RA-FLS w zachowaniu podobnym do nowotworowego, prowadząc do zapalenia błony maziowej, zniszczenia stawu i tworzenia pannusa poprzez różne mechanizmy, w tym aktywację szlaku MAPK/kinazy N-końcowej Jun, szlaku MAPK/kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym i podwyższoną regulację MMP1 i MMP3, które odgrywają kluczową rolę w agresywnym zachowaniu FLS.

Według badań, nadmiernie wyrażone komponenty sygnalizacji Hedgehog, w tym Ptch1, Smo i Gli1, znaleziono w tkankach maziowych RA i kulturach FLS. Idąc tymi samymi liniami, nasze wyniki wykazały, że nieleczone szczury z zapaleniem stawów znacząco podwyższyły ekspresję genów Shh, Smo, ptch1 i Gli-1 w tkance stawowej. “Fortunnie, leczenie DAPA samodzielnie lub w połączeniu z MTX dramatycznie stłumiło nadmierną ekspresję genów Shh, Smo, ptch1 i Gli-1 w tkance stawowej w porównaniu z samym MTX” – piszą badacze. Te wyniki wyjaśniają, że DAPA łagodzi patogenezę RA poprzez hamowanie nadaktywacji szlaku Hedgehog, ważnego czynnika w progresji choroby, przyczyniającego się do zapalenia stawów i zniszczenia chrząstki.

Indukcja zapalenia stawów skutkowała znaczną regulacją w górę genów szlaku sygnałowego Hedgehog we wszystkich grupach skorelowanych z grupą kontrolną. Ekspresje SHh, Ptch1, Smo i Gli-1 u nieleczonych szczurów z zapaleniem stawów wzrosły odpowiednio o 133, 190, 155 i 133% w porównaniu ze zdrowymi nieartretycznymi. Podawanie samego MTX znacznie zmniejszyło ekspresję genów SHh, Ptch1, Smo i Gli-1 w tkance stawowej odpowiednio o 10, 10, 22 i 16% w porównaniu z grupą leczoną AIA. W porównaniu z nieleczonymi szczurami z zapaleniem stawów, monoterapia DAPA znacznie zmniejszyła ekspresję genów SHh, Ptch1, Smo i Gli-1 w tkance stawowej odpowiednio o 30, 31, 39 i 29%. Warto zauważyć, że monoterapia DAPA wykazała dalsze poprawy w ekspresji wszystkich genów autofagii w porównaniu z leczeniem MYX samym. Co ciekawe, współleczenie MTX i DAPA znacznie osłabiło ekspresję genów SHh, Ptch1, Smo i Gli1 odpowiednio o 34, 47, 37 i 31% w porównaniu z samym MTX, a dodatkowe wzrosty zauważono we wszystkich genach w stosunku do monoterapii DAPA.

Celowanie w powiązania szlaków sygnałowych w wielu zaburzeniach, zwłaszcza RA, jest obiecującym podejściem do ewolucji nowych środków terapeutycznych. AMPK, istotny regulator kaskady zapalnej, odgrywa główną rolę w powiązaniach między autofagią i apoptozą w różnych stanach patologicznych. AMPK jest koncepcyjnie powiązany z różnymi etapami autofagii. Z drugiej strony, sugerowano, że AMPK reguluje apoptozę komórek w stresujących okolicznościach. Fosforylacja AMPK prowadzi następnie do stymulacji proapoptotycznych mediatorów p53 i Bax, zachęcając w ten sposób komórki do przejścia apoptozy.

Ponadto, AMPK jest również powiązany z regulacją sygnału Hedgehog w poprzednich badaniach. Jeden z inhibitorów SGLT2 indukował fosforylację AMPK, co hamowało ekspresję szlaku Hedgehog, tym samym przywracając apoptozę i zapobiegając nieprawidłowej proliferacji komórek nowotworowych.

Podkreślając nasze odkrycia, DAPA silnie celował w AMPK, kluczowy kontroler kaskady zapalnej. DAPA zatrzymał indukowany przez CFA stan zapalny NF-κB i kaskadę downstream TNF-α, IL-1β i IL-6. Według niedawnych badań, zgłoszono, że DAPA tłumi stan zapalny i wzmacnia autofagię poprzez aktywację fosforylacji AMPK w różnych modelach zwierzęcych.

W tym miejscu, DAPA aktywował fosforylację AMPK z następującym wzmocnieniem procesu autofagii, poprzez podwyższone ekspresje ULK-1, ATG-7 i Beclin-1 w tkance stawowej. Nasze badanie wykazało, że indukowany przez DAPA efekt AMPK doprowadził do przywrócenia apoptozy w tkance artretycznej, poprzez aktywację CASP-3, CASP-9 i p53 w tkance stawowej, a także wzmocnienie stosunku Bax/Bcl2. Dodatkowo, pośredniczona przez DAPA fosforylacja AMPK może zaangażować się w jego działanie hamujące sygnał Hedgehog, co ilustruje obniżona regulacja Gli-1, Smo i ptch1 w tkance stawowej. Wszystkie te korzystne wpływy DAPA odzwierciedliły się w poprawie AI, wyniku chodu i obrzęku łapy, wraz ze zmniejszonymi poziomami markerów zapalenia stawów RF, MMP-1 i MMP-3. Dlatego DAPA poprawił pogorszenia histopatologiczne w tkankach stawowych wywołane przez podawanie CFA.

Podczas obecnego badania, mieliśmy na celu wyjaśnienie możliwych efektów przeciwartretycznych monoterapii DAPA, dodatkowo do potencjalnego korzystnego wpływu łączenia DAPA z MTX jako ustalonego leku do leczenia RA. MTX jest uważany za najbardziej konwencjonalną terapię RA od lat 80. do dziś i często nazywany jest lekiem pierwszej linii do leczenia RA, niezależnie od poważnych ograniczeń związanych z długotrwałym użytkowaniem, takich jak uszkodzenie wątroby, infekcja i rozwijanie chłoniaka. Dlatego MTX został użyty w tym badaniu jako standardowe odniesienie terapeutyczne do leczenia RA. Mechanizm leżący u podstaw skuteczności MTX w RA został wcześniej opisany przez kilka teorii. Obejmują one antagonistyczne efekty folianów, sygnalizację adenozyny, indukcję stresu oksydacyjnego, redukcję cząsteczek adhezyjnych, modyfikację profili cytokin i tłumienie stanu zapalnego. Wynik przeciwzapalny MTX tylko odnosił się do podwyższonych poziomów adenozyny. Jednak wpływ MTX na poważne szlaki sygnałowe zaangażowane w RA, takie jak Hedgehog i autofagia, oraz dokładny podstawowy molekularny mechanizm przeciwzapalny, nie został jasno zdefiniowany.

Wcześniejsze badania dotyczące MTX zgłosiły znacznie obniżone poziomy MMP-3 we krwi bez dowodów na poziomy MMP-1 u pacjentów z RA. Porównując mechanizm przeciwartretyczny między monoterapiami MTX i DAPA, stwierdziliśmy, że DAPA znacznie poprawił miary MMP i RF w surowicy, prowadząc do normalizacji tych markerów w terapii kombinowanej. Ciekawie, monoterapia DAPA przeważała w lepszych działaniach w utrudnianiu kaskady zapalnej w porównaniu z monoterapią MTX w kierunku wszystkich mediatorów zapalnych ocenianych w obecnej pracy, szczególnie poprzez zwiększoną aktywność fosforylacji AMPK w tkance stawowej szczurów z zapaleniem stawów, dodając taką korzyść do leczenia MTX, w którym ten ostatni nie zdołał tego osiągnąć. Taka przewaga sprawiła, że MTX korzysta z schematu kombinacji z DAPA, dając terapii kombinowanej lepszy wpływ przeciwzapalny nad obiema monoterapiami.

Podczas gdy większość badań MTX w RA ujawniła aktywowany szlak JNK i następującą indukcję ekspresji genu p53, nie ma dokładnie szczegółowych badań związanych z jego efektem nad innymi markerami apoptotycznymi. Podczas obecnego badania, DAPA osiągnął bardziej wybitne efekty autofagiczne i apoptotyczne niż MTX w ekspresjach CASP-3 i P53 w tkance stawowej i wszystkich ocenianych parametrach autofagicznych. Nasza analiza wykazała, że łączenie DAPA z MTX zapewniło MTX dalszą aktywność autofagiczną i apoptotyczną przeciwko inwazyjnym tkankom RA, celując w dwa skrzyżowane szlaki odpowiedzialne za degradację chrząstki i stawu. Obecny wynik jest uważany za nowe odkrycie dla aktywności autofagicznej MTX, które przyszło w kontraście z poprzednim badaniem, które wykazało zmniejszone poziomy mRNA i białka genów związanych z autofagią ATG (3, 5, 12), ULK1 i Beclin1 u szczurów z zapaleniem stawów leczonych MTX.

Poprzednie badanie zgłosiło możliwy wpływ MTX na szlak Hedgehog, gdy tylko w połączeniu z kurkuminą do leczenia mięsaka kościopochodnego, nie dla RA. W tym miejscu, monoterapia DAPA osiągnęła dominującą poprawę w tym poważnym szlaku w korelacji z samym MTX. Dodatkowo, łączenie DAPA z MTX zyskało obie monoterapie dalszą poprawę w sygnale Hedgehog, wspierając odkrycie poprzedniego badania i oferując cenną korzyść terapeutyczną poprzez modulowanie szlaku odpowiedzialnego za nieprawidłowe namnażanie FLS w RA.

Podsumowując, nasze badania wykazały pierwsze dowody na łagodzące efekty DAPA przeciwko modelowi artretycznemu indukowanemu CFA u szczurów, samodzielnie lub jako uzupełnienie konwencjonalnej terapii RA. DAPA certyfikował się jako środek wielocelowy, celując w AMPK, znak rozpoznawczy wzajemnej gry między apoptozą i autofagią, a także szlaki Hedgehog. “Te nowo odkryte wpływy przeciwartretyczne DAPA można przypisać jego właściwościom przeciwzapalnym, autofagicznym i modulacji apoptozy, powiązanym z hamowaniem parametrów sygnalizacji Hedgehog” – konkludują badacze. Niemniej jednak, zalecamy dalsze badania nad możliwym potwierdzeniem DAPA u pacjentów z RA i innymi powiązanymi zaburzeniami zapalnymi, jako monoterapii lub jako uzupełnienia konwencjonalnych schematów.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie skuteczności dapaglifloziny (DAPA) w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), zarówno w monoterapii, jak i w połączeniu z metotreksatem (MTX). Wykazano, że DAPA w dawce 10 mg/kg/dzień wykazuje najlepsze działanie przeciwzapalne i przeciwartretyczne. Lek skutecznie zmniejsza stan zapalny, obrzęk stawów oraz poprawia parametry chodu u zwierząt laboratoryjnych. DAPA działa poprzez modulację szlaku AMPK, regulację procesów autofagii i apoptozy oraz hamowanie szlaku Hedgehog. Kombinacja DAPA z MTX wykazała synergistyczne działanie, prowadząc do lepszych wyników terapeutycznych niż monoterapia każdym z leków. Badanie ujawniło, że DAPA może stanowić obiecującą opcję terapeutyczną w leczeniu RA, szczególnie jako uzupełnienie konwencjonalnej terapii metotreksatem.